کروماتوگرافی اندازه طردی Size Exclusion Chromatography

کروماتوگرافی اندازه طردی Size Exclusion Chromatography یکی از روش های جداسازی در شیمی تجزیه می باشد که به طور کلی برای تهیه محلول های استخراجی مورد استفاده قرار می گیرد برای مثال، برای خارج کردن چربي ها و موم از پسماند حشره کش ها يا ترکيبات مواد غذایی استفاده مي شود. در ادامه از جم شیمی به بررسی مبانی و اصول انجام و تکنیک های کروماتوگرافی اندازه طردی یا به عبارت ساده تر(SEC) یا کروماتوگرافی اندازه ای می پردازیم. فاز ساکن در کروماتوگرافی اندازه ای ماتریس پلیمری است که خلل و فرج آن سايز منافذ گستره وزن مولکولی ترکيباتي را که می توانند جداسازی شوند تعيين می کند. این روش برای تعیین وزن مولکولی پلیمرها نیز به کار برده می شود.

کروماتوگرافی اندازه طردی که با عناوین کروماتوگرافی ژل تراوایی (Gel permeation chromatography, GPC) و یا کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی (Gel Filtration Chromatography, GFC) نیز مترادف است، تکنیکی قوی برای جداسازی و آنالیز ترکیبات با جرم مولکولی بالاست. این روش در سال 1954 معرفی شد و در سال 1959 توسعه داده شد. در این روش جداسازی بر مبنای اندازه موثر و شکل مولکول ها صورت می گیرد و برخلاف دیگر روش های کروماتوگرافی، برهم کنش های شیمیایی یا فیزیکی آنالیت با فاز ساکن در جداسازی دخیل نیست و حتی از این برهم کنش ها به علت کاهش کارایی ستون باید اجتناب شود. طبق يک قاعده و اصلی کلي ترکيباتي که 10 درصد در اندازه تفاوت دارند مي توانند در يک ستون مشابه جداسازي شوند. يک سری از ستون ها، که با ژل های دارای حد طرد مختلف پر مي شوند می توانند براي جداسازی يک مخلوط چند جزئی مورد استفاده واقع شوند. صاف کردن به وسيله ژل، يک روش سريع و مؤثر دياليز برای نمک زدايی و تبادل بافر می باشد. به عنوان مثال، اين روش در آماده سازی نمونه های پروتئينی پيش از انجماد خشک يا جزء به جزء کردن به وسيله تبادل يونی مورد استفاده قرار مي گيرد.

کاربردهای کروماتوگرافی اندازه طردی Size Exclusion Chromatography شامل:

اساس کروماتوگرافی اندازه طردی Size Exclusion Chromatography

ستون کروماتوگرافی به طور کامل با حلالی که به عنوان فاز متحرک استفاده می شود، پر می شود. اندازه منافذ بحرانی است از این جهت اساس جداسازی این است که مولکول های بزرگ تر از این اندازه بحرانی، به طور کلی از این منافذ طرد می شوند و داخل منافذ برای مو لکول های کوچک تر قابل دست یابی می باشد. جریان فاز متحرک باعث خواهد شد که مولکول های بزرگ تر از میان ستون بگذرند، بدون نفوذ در ماتریس ژل، در حالی که مولکول های کوچک تر بسته به نفوذ آن ها در ژل بازداری می شوند. به دلیل آن که مولکول های بزرگ نمی توانند در ژل نفوذ کنند و از ستون شسته و خارج می شوند بنابراین مولکول های بزرگ تر اول خارج می شوند.

فازهای ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی اندازه طردی، مواد متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند که اجزاء نمونه بر اساس اختلاف در اندازه مولکولی از هم تفکیک می شوند. در واقع فاز ساکن در این روش شبیه یک غربال یا الک مولکولی رفتار می کند. مولکول های کوچک تر از اندازه منافذ فاز ساکن وارد آنها می شوند و مولکول های بزرگتر از اندازه منافذ دفع یا طرد می گردند. بالاترین جرم مولکولی یک گونه که می تواند وارد منافذ شود را حد طرد (exclusion limit) گویند.

  مولکول های بزرگتر از حد طرد توسط ستون بازداری نشده و سریع تر از ستون خارج می شوند ولی مولکول های کوچک تر در داخل و خارج منافذ پخش شده و دیرتر از ستون خارج می شوند. مولکول های با اندازه های مختلف با سرعت های متفاوت از ستون خارج می شوند. ترکیباتی که اصلا وارد منافذ نمی‌شوند و همچنین مولکول‌های کوچکی که کاملا در منافذ نفوذ می‌کنند، از یکدیگر جدا نمی‌شوند. مولکول‌های با اندازه متوسط، بر حسب درجه نفوذ آنها در خلل و فرج فاز ساکن در ستون نگه داشته می‌شوند.

  اگر مواد ترکیب شیمیایی مشابه داشته باشند، به ترتیب جرم مولکولی نسبی از ستون شسته می‌شوند. از آن جایی که اندازه مولکول نسبت مستقیم با جرم آن دارد، مولکویی های با وزن کمتر بیشتر از مولکول های با جرم زیاد در ستون نگه داشته می شوند. بنابراین در کروماتوگرام SEC پیک های ابتدایی مربوط به مولکول های بزرگتر و پیک های نهایی مربوط به مولکول های کوچک تر با زمان بازداری مشخص هستند.

دو نوع فاز ساکن در SEC استفاده می شود: دانه های پلیمری (Polymer beads) و ذرات پایه سیلیکایی (Silica-based particle)، که معمولا قطری بین ۵-۱۰ میکرومتر دارند. ذرات با پایه سیلیکا راحت تر فشرده شده و در فشار بالا قابل استفاده هستند، پایداری بالایی دارند که امکان استفاده از حلال های مختلف از جمله آب را مهیا می کند، تعادل سریع دارند و در دمای بالا نیز پایدارند. اما این ذرات تمایل به جذب سطحی حل شونده ها دارند و پتانسیل کاتالیز تخریب مولکول های حل شونده را دارند.

اين کار به جداسازی منجر مي شود، زيرا مستلزم حلال بيشتري است تا مولکول های کوچک تر را از ژل شستشو و خارج کند. البته در اين کار حدی وجود دارد. اگر مولکول ها خيلي کوچک باشند، اندازه آن ها در مقايسه با منافذ آن قدر کوچک است که مانند هم رفتار کرده و به يک ميزان حلال براي شويش نياز دارند. اين حجم ، حجم کل نفوذ (v_t) ناميده مي شود. V_i حجم مايع داخل ماتريس (interstritial volum) است.

V_t=V₀ +V_i+ V_m

V_t حجم کل ستون (که می تواند اندازه گیری شود) و V₀ مجموع حجم مایع خارج ماتریس و حجم ماتریس ژل V_m می باشد. کوچکترين وزن مولکولی نسبت به مولکولي که نمی تواند وارد ژل شود، حد طرد نام دارد، و حجم مورد نياز برای شويش مولکول های بزرگ حجم باطل (void volum) نام دارد. مولکول های کوچک تر می توانند در ژل نفوذ کنند و کوچک تر بودن مولکول، نفوذ بيشتر و تاْخير زيادتر را به همراه دارد.

تمام گونه هایی که به طور کامل از ژل طرد می شوند از یکدیگر جداسازی نمی شوند و به طور مشابه مو لکول های کوچکی که کاملاً در ژل نفوذ کنند جداسازی نمی شوند. مو لکول هایی با اندازه حد واسط بسته به درجه نفوذشان در ژل بازداری می شوند. اگر مواد از نظر شیمیایی مشابه باشند به ترتیب جرم ملکولی نسبی شویش می شوند اثرات جذبی ایجاد شده به وسیله سطح ذرات ژل معمولاً قابل چشم پوشی می باشد و بنابراین ژل کروماتوگرافی را می توان نوعی کروماتوگرافی تقسیمی در نظر گرفت. فاز ساکن مایع- مایع درون ماتریس ژل می باشد و فاز متحرک شوینده در حال جریان است که باقیمانده ستون را احساس می کند. به عبارت دیگر یک ستون تقسیمی در اختیار داریم که دو فاز مایع ( ساکن و متحرک ) ترکیب یکسان دارند.

در ابتدا ژل کروماتوگرافی برای جداسازی مواد بیولوژیکی به کار می رفت زیرا اولین ژل دکستران با اتصالات عرضی برای استفاده با سیستم های آبی مناسب بودند. در سال 1964 ژل های پلی استایرن با اتصالات عرضی مناسب استفاده با حلال های آلی برای اولین بار تهیه شوند. کاربرد این روش نه تنها برای جداسازی بلکه برای تعیین جرم مو لکولی نسبی بکار می رود.

نکته ی مهم اینجاست که اگر حفره ها یک اندازه باشند، روش SEC دیگر کار نمی کند. حفره ها باید در اندازه های مختلف باشند. دلیلش این است که: وقتی شما محلول پلیمری را از میان ستون عبور می دهید، مولکول های پلیمر از مسیرشان منحرف می شوند. زنجیرها داخل سوراخ های دانه ها گیر می افتند. اما در نظر داشته باشید که زنجیرها برای همیشه انجا باقی نمی مانند. یک مولکول پلیمری داخل یک حفره به دام می افتد، سپس بیرون می آید، در داخل لوله کمی حرکت می کند و دوباره داخل حفره ی دیگری به دام می افتد. در آن جا مدتی باقی می ماند، سپس بیرون می آید و مسافت کمی را داخل لوله طی می کند تا حفره ی مناسب دیگری را پیدا کند… پس از مدتی مولکول پلیمر به انتهای ستون می رسد.

امّا مولکول‌های پلیمر، همگی در یک زمان مساوی از ستون خارج نمی شوند؛ یعنی برخی از زنجیر‌های پلیمر زمان طولانی‌تری را برای خروج از داخل ستون نسبت به زنجیره‌های دیگر نیاز دارند. مولکول‌های پلیمری بزرگ با وزن‌های مولکولی بالا نمی توانند داخل حفره‌های کوچک قرار بگیرند. پس چون تعداد حفره‌هایی که مولکول‌های بزرگ می‌توانند داخل آنها شوند کمتر است، این ذرات از داخل ستون نسبتاً سریع عبور می‌کنند. امّا مولکول‌های پلیمری کوچکتر با وزن‌های مولکولی کمتر، در داخل حفره‌های کوچک گیر می‌افتند و چون این مولکول‌ها در داخل حفره‌های بیشتری جا می‌شوند، واضح است که در حفره‌های بیشتری هم گیر می‌کنند. بنابراین زمان بیشتری طول می‌کشد تا از داخل ستون عبور کنند.

نکات مهم و مزیت ها در کروماتوگرافی اندازه طردی Size Exclusion Chromatography

معایب کروماتوگرافی اندازه طردی Size Exclusion Chromatography

عدم جداسازی ترکیبات با اندازه یکسان مانند ایزومرها (isomers) یکی از معایت این روش می باشد در مورد SEC اشکالی نیز وجود دارد در حقیقت ما جرم را اندازه نمی گیریم بلکه حجم هیدرودینامیک مولکول های پلیمر را می سنجیم؛ یعنی این که یک مولکول معین پلیمری وقتی در محلول است چه مقدار فضا را اشغال کرده است. می توانیم وزن مولکولی را از داده های SEC تخمین بزنیم، زیرا ارتباط دقیق بین وزن مولکولی و حجم هیدرودینامیکی پلیاستایرن را می دانیم و از آن به عنوان استاندارد استفاده می کنیم. اما رابطه حجم هیدرودینامیکی و وزن مولکولی برای همه پلیمرها یکسان نیست، بنابراین ما فقط یک اندازه گیری تقریبی انجام می دهیم. البته روش هایی هم برای جامعیت بخشیدن به روش SEC وجود دارد که توضیح آن در اینجا قدری تخصصی است.

آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی اندازه طردی 

پرکاربرد ترین نوع آشکارساز در کروماتوگرافی اندازه طردی SEC آشکارساز ضریب شکست (Refractive Index, RI) است. آشکارساز پراش نور (light scattering detector) آشکارساز زیرقرمز (IR) و آشکارساز ماوراء بنفش (Uv/Vis) نیز در مواردی که آشکارساز RI مفید نباشد مورد استفاده قرار می گیرند. آشکارسازهای دیگر مانند آشکارساز فلورسانس و الکتروشیمیایی خیلی کمتر در این روش به کار می روند.