فازهای ساکن در کروماتوگرافی مایع برهمکنش هیدروفیلیک HILIC

فازهای ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع برهمکنش های هیدروفیلیک یا آبدوست HILIC که یکی از تکنیک ها و روش های جداسازی در شیمی تجزیه می باشد. فازهای ساکن کروماتوگرافی برهمکنش آبدوست Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography عموما بر اساس بار دار بودن یا نبودن گروه های عاملی روی آن تقسیم بندی می شوند که بر این اساس می توان آن ها را به سه دسته ی زیر تقسیم بندی کرد.

کروماتوگرافی مایع برهمکنش آبدوست (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

این روش که برای جداسازی ترکیبات قطبی مانند پپتیدها، قندها، استیدهای آمینه، استیدهای کربوکستیلیک، بازهای نوکلئوتید و … استفاده می شود. از نظر فاز ساکن شبیه کروماتوگرافی فاز نرمال بوده (فاز ساکن قطبی) با این تفاوت که، فاز متحرک آن نیز قطبی می باشد. در نتیجه به دلیل حلالیت بیشتر نمونه های قطبی در فاز ساکن سرعت واجذب نمونه از روی فاز ساکن بیشتر شده و علاوه بر جداسازی مناسب، سرعت آنالیز را نیز بالا می برد.

فاز ساکن و فاز متحرک در کروماتوگرافی مایع برهمکنش آبدوست (HILIC)

در این روش همان طور که گفته شد از فاز ساکن قطبی ( بارداریا بدون بار) مانند دی ال، آمید، آمین، انواع فازهای ساکن زوج یون و … استفاده می شود. و همچینین فاز متحرک شامل یک حلال آلی (به طور معمول استونیتریل بین 60 تا 95 درصد) ویک حلال پروتیک (معمولا آب همراه با نمک های فرار مانند آمونیوم استات) می باشد. استفاده از آب در این سیستم باعث حلالیت بیشتر ترکیبات قطبی در فاز متحرک می شود و همچنین درصد بالای حلال آلی امکان استفاده از شدت جریان بالاتر بدون ایجاد فشار بالا را نسبت به کروماتوگرافی فاز معکوس را فراهم می کند

فازهای ساکن مورد استفاده در HILIC

• فاز های ساکن بدون بار (خنثی)
• فاز های ساکن باردار
• فاز های ساکن زوج یون

فازهای ساکن بدون بار یا خنثی

فازهای ساکن بدون بار شامل فازهای ساکنی می شود که گروه های عاملی روی فاز ساکن در با دامنه 3 تا 8 بدون بار بوده و در نتیجه نمی توانند شرایط برهمکنش های تعویض یون را فراهم کنند در نتیجه مکانیسم در این گونه فاز های ساکن به برهمکنش های آب دوست محدود می شوند. البته باید این نکته در نظر شود که در فاز های ساکن با پایه ی سیلیکاژل و در pH بالا 4-5 گروه های سیلانول پروتون خود را از دست می دهند و در نتیجه بار منفی ایجاد شده می تواند در برهمکنش های الکترواستاتیک شرکت کند. اکثریت فاز های به کار رفته در HILIC در این دسته قرار می گیرند که شامل طیف وسعی از فاز های ساکن مانند دی ال ها، فاز های ساکن آمیدی، قند ها، ،سیکلودکسترین و… می شود.

فازهای ساکن باردار

فاز های ساکن باردار دارای گروه های عاملی قطبی هستند که می توانند با از دست دادن یا گرفتن پروتون، باردار شوند که نوع بار (منفی یا مثبت) بسته به pH فاز متحرک مشخص می شود. در این شرایط، جداسازی آنالیت در کنار مکانیسم توزیع با مکانیسم تبادل یون همراه خواهد بود. در میان فاز های ساکن باردار فاز های ساکن آمینی و سیلیکا بیشترین کاربرد را در جداسازی با استفاده از سیستم HILIC پیدا کرده است.

فازهای ساکن زوج یون

فاز های ساکن زوج یون شامل گروه عاملی با میزان برابر از بار مخالف یکدیگر بر روی سطح سیلیکا هستند. لیگاند های زوج یون عموما تشکیل شده از یک گروه اسیدی مانند سولفونیک اسید و یک گروه بازی مانند آمین نوع چهارم هستند که به pH فاز متحرک حساس نیستند. فاز های ساکن زوج یون توانایی بالایی در جذب آب در سطح خود دارند که در نتیجه ی این عمل مکانیسم توزیع برای آنالیت ایجاد می-شود. از طرف دیگر هر دو گروه سولفات و فسفات پذیرنده ی هیدروژن هستند که می توانند برهم‌کنش خوبی با آنالیت های دهنده ی هیدروژن داشته باشند، به علاوه وجود گروه های باردار سبب ایجاد برهمکنش های الکترواستاتیک می شوند که تاثیر زیادی در بازداری آنالیت خواهد داشت.

در پایان می توان گفت فاز های ساکن زوج یون دارای کاربرد های ویژه ای در آنالیز اسید ها، باز ها وترکیبات زوج یون هستند که ازین ویژگی می توان در جداسازی پپتید ها، فنول ها، و بسیاری از متابولیت های موجود در بدن انسان استفاده کرد. ستون های تجاری این دسته از فاز ساکن به ستون های ZIC-HILIC و ZIC-cHILIC معروف هستند.

مکانیسم بازداری در HILIC

در HILIC معمولا اعتقاد بر این است که مولکول های آب توسط گروه¬های قطبی بر روی فاز ساکن (به عنوان مثال سیلانولدهای سطحی) جذب می شوند و یک لایه ی نیمه راکتی را ایجاد می کنند ( شکل زیر) سپس از طریق توزیع دیفرانسیلی آنالیتدها بین لایه ی غنی شده با آب روی فاز ساکن و فاز متحرک با قطبیت کمتر (غنی از استونیتریل) جداسازی آنالیز ها بر اساس قطبیت آن ها را حاصل می شود. پس در نتیجه مکانیسم پیشنهادی برای بازداری نمونه ها در HILIC مکانیسم توزیع است.
پس میتوان گفت نمونه ها با قطبیت بالا به سمت توزیع در لایه ی آبی تمایل پیدا می کنند و که این عمل باعث افزایش بازداری این نمونه ها می شود. در مقابل با افزایش آب در فاز متحرک و افزایش قطبیت فاز متحرک لایه ی آبی روی فاز ساکن با استونیتریل جایگزین شده و با تغییر مکانیسم جداسازی توزیع نمونه ها به سمت فاز متحرک بیشتر شده و در نتیجه بازداری این ترکیبات قطبی کمتر شده و از ستون خارج می شوند.

پارامتر های موثر در بازداری ترکیبات در HILIC

•  درصد آب و نوع حلال آلی
• اثر نوع و غلظت نمک
• اثر pH فاز متحرک
• تاثیر دما

علاوه بر مکانیسم توزیع، مکانیسم های دیگری در جداسازی با روش HILIC مانند برهمکنش های هیدروژنی بین نمونه های قطبی و همچنین جاذبه یا دافعه ی الکترواستاتیک (در نمونه ها و فاز های ساکن باردار) وجود دارد. پس در نهایت مکانیسم کلی جداسازی در شستشوی نمونه از سطح فاز ساکن، حاصل برآیند مکانیسم توزیع، برهمکنش های دو قطبی-دو قطبی و برهمکنش های الکترواستاتیک است که سهم هر کدام وابسته به شرایط جداسازی ازجمله نوع فاز ساکن، درصد آب موجود در فاز متحرک و ماهیت فاز متحرک (نوع و غلظت نمک و pH) است.

لازم به ذکر است که قابلیت اتصال این روش به اسپکترومتری جرمی باعث گستردگی این روش در جداسازی و شناسایی ترکیبات قطبی و فعال بیولوژیک مانند داروها، پپتیدها، پروتئین ها،اسیدهای آمینه، قندها، فلاونوئیدها و غیره شده است.